Điều gì có thể là vấn đề nếu các ban nhạc không xuất hiện trong Western Blot?

Câu trả lời:

Nhiều …

Giải trình:

Có nhiều lý do tại sao các ban nhạc có thể không xuất hiện trên một blot phương Tây. Các kết hợp mẫu và kháng thể đã làm việc trong quá khứ?

Dưới đây chỉ là một số điều mà tôi có thể nghĩ đến vào lúc này có thể khiến các ban nhạc không xuất hiện:

1. Có phải protein chuyển từ gel? Hãy thử nhuộm màng với một cái gì đó như ponceau S hoặc amido đen để xem các dải có mặt không. Đôi khi, bạn có thể nhìn thấy các dải protein trên màng bằng cách làm ướt nó và giữ nó ở một góc với ánh sáng.

2. Là kháng thể chính làm việc? Đây là một thử thách khó khăn để kiểm tra và cách duy nhất bạn có thể là bằng cách bao gồm một kiểm soát tích cực nơi bạn biết bạn có protein quan tâm. Nếu bạn có một số protein quan tâm, bạn có thể thử phát hiện ra nó trên màng thấm nước phương Tây (tức là bạn không chạy gel) và xem liệu bạn có nhận được kết quả nếu bạn xử lý màng như thể đó là một đốm màu phương Tây.

3. Là kháng thể thứ cấp nhận ra kháng thể chính? Một lần nữa, một khó khăn để kiểm tra. Về bài kiểm tra duy nhất bạn có thể làm là bài kiểm tra tại chỗ được đề cập ở trên trong 2.

4. "Hệ thống phát hiện" có hoạt động không? Tùy thuộc vào phương pháp phát hiện bạn đang sử dụng, bạn có thể thử đạp xe trong một số kháng thể thứ cấp để xem liệu giải pháp phát hiện, và cả tác nhân / enzyme kích hoạt trên kháng thể thứ cấp, có hoạt động không. Đó là, bạn có thể kích hoạt phản ứng chỉ với kháng thể thứ cấp?

Cuối cùng, nó có thể đơn giản như một trong những giải pháp được sử dụng trong quá trình thăm dò cốt truyện được tạo thành không chính xác. Ví dụ, nếu nồng độ muối sai trong bộ đệm thì điều này có thể khiến các kháng thể được giải phóng khỏi blot. Điều tương tự cũng sẽ xảy ra nếu độ pH của bộ đệm không chính xác.

Nguyên nhân "kỳ lạ nhất" khiến một blot tây không hoạt động mà cá nhân tôi đã trải nghiệm là khi chúng tôi thay đổi nhà cung cấp sữa bột mà chúng tôi sử dụng để chặn màng. Bột từ nhà cung cấp mới có chứa phosphotyrosine phosphatase đã loại bỏ tất cả các nhóm phosphate mà chúng tôi đang cố gắng phát hiện bằng kháng thể chống phosphotyrosine.